Annexin V-EGFP/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

規(guī)格:20T/50T/100T，價(jià)格：400/700/1200元，產(chǎn)品簡介

Annexin是一類廣泛分布于真核細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子依賴的磷酯結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Annexin V可選擇性結(jié)合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡稱PS)。磷酯酰絲氨酸主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會把磷酯酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。磷酯酰絲氨酸暴露到細(xì)胞表面后會促進(jìn)凝血和炎癥反應(yīng)。而Annexin V和外翻到細(xì)胞表面的磷酯酰絲氨酸結(jié)合后可以阻斷磷酯酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應(yīng)活性。因此Annexin V被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。用帶有綠色熒光的熒光探針EGFP標(biāo)記的Annexin V，即Annexin V-EGFP，就可以用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡非常簡單而直接地檢測到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。與FITC的綠色熒光信號相比，EGFP的綠色熒光信號具有信號強(qiáng)，不易淬滅，穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。Annexin V-EGFP細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-EGFP Apoptosis Detection Kit)是用EGFP標(biāo)記的重組人Annexin V來檢測細(xì)胞凋亡時(shí)出現(xiàn)在細(xì)胞膜表面的磷酯酰絲氨酸的一種細(xì)胞凋亡檢測試劑盒?？梢允褂昧魇郊?xì)胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設(shè)備進(jìn)行檢測。本試劑盒還提供了碘化丙啶染色液，碘化丙啶可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的完整性已經(jīng)喪失，Annexin V-EGFP可以進(jìn)入到細(xì)胞漿內(nèi)，與位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰絲氨酸結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開來。

試劑盒組份

試劑盒組份 20 assays  50 assays 100 assays儲存條件

Annexin V-EGFP 100μL 250μL 500μL 4℃避光

結(jié)合液 15 mL 40 mL 75mL 4℃

碘化丙啶 （PI） 100μL 250μL 500μL 4℃避光

試劑盒以外自備儀器和試劑

流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡、低速離心機(jī)、移液器,1.5m L離心管、載玻片、蓋玻片、PBS、不含EDTA的胰酶消化液

操作步驟

1、對于懸浮細(xì)胞：A、在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后，1000g (約1000-2000rpm) 離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。（注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時(shí)也起到了洗滌細(xì)胞的作用，可以保證后續(xù)Annexin V-EGFP的結(jié)合。）B、取1~5×105重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，注意要把PBS吸干凈，（選做步驟：加入250ul的結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清）加入500µl 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。C、加入5µl Annexin V-EGFP，輕輕混勻；再加入5 μL 碘化丙啶，輕輕混勻。D、室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘?？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。E、隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-EGFP為綠色熒光，PI為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡下檢測，滴一滴上述染色后的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞即可檢測。2、對于貼壁細(xì)胞：A、把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，用胰酶細(xì)胞消化液(最好不用含有EDTA)消化細(xì)胞。（注：胰酶消化時(shí)間不易過長，否則容易引起假陽性）B、細(xì)胞消化下來后，加入步驟2A中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。C、取1~5×105重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，注意要把PBS吸干凈，（選做步驟：加入250ul的結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清）加入500µl結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。D、加入5µl Annexin V-EGFP，輕輕混勻；再加入5 μL 碘化丙啶，輕輕混勻。E、室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘?？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。F、隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-EGFP為綠色熒光，PI為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡下檢測，滴一滴上述染色后的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞即可檢測。3、對于貼壁細(xì)胞的原位熒光顯微鏡檢測：注：本方法的優(yōu)點(diǎn)是可以原位觀察細(xì)胞凋亡，缺點(diǎn)是部分凋亡由于不貼壁而檢測不到。A、(選做)如果條件許可，把細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板、48孔板或96孔板內(nèi)；或?qū)⒓?xì)胞于蓋玻片上生長，用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并設(shè)立陰性對照組。B、吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌兩次；或?qū)⑸w玻片用PBS洗滌兩次。（選做步驟：用250ul的結(jié)合液洗滌蓋玻片一遍）C、在500μL 的結(jié)合液中加入5μL Annexin V-EGFP， 5 μL碘化丙啶，輕輕混勻。D、將上述溶液滴加于培養(yǎng)板孔中，或滴加于蓋玻片表面，使長有細(xì)胞的蓋玻片表面均勻覆蓋。E、室溫(20-25℃)避光孵育10分鐘; 隨即在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-EGFP為綠色熒光，PI為紅色熒光。

保存條件

4℃保存，Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色液需避光保存，一年有效。為長期保存，可以把Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色液適當(dāng)分裝后-20℃保存，Annexin V-EGFP結(jié)合液可以直接-20℃保存。

注意事項(xiàng)

1、如果有細(xì)菌或真菌污染，會嚴(yán)重影響檢測效果。2、染色后宜盡快檢測，時(shí)間過長可能會導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。同時(shí)熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進(jìn)行熒光觀察時(shí)，盡量縮短觀察時(shí)間，同時(shí)在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。3、如果檢測時(shí)Annexin V-EGFP的熒光比較弱，建議用250ul的結(jié)合液輕輕重懸洗滌細(xì)胞，去除殘余的磷酸鹽溶液，同時(shí)也可縮小結(jié)合液的體積（比如200ul的體積）來提高Annexin V-EGFP的工作濃度。4、為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。5、本試劑盒適用于檢測活細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測時(shí)，細(xì)胞數(shù)量不以應(yīng)低于1×105，，不適用于檢測組織樣本。6、因檢測細(xì)胞的類型、凋亡誘導(dǎo)劑種類、使用的檢測儀器不同，因而流式檢測的熒光補(bǔ)償也不同，因此建議每次檢測均需使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的細(xì)胞作為對照，進(jìn)行熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)。7、用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長Ex=488 nm; 發(fā)射波長Em=530 nm。Annexin V-EGFP的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測；PI紅色熒光通過PI通道（FL2或FL3）檢測，建議使用FL3。熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)：使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞，作為對照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。