熒光免疫技術基本原理

熒光免疫技術是標記免疫技術中發(fā)展zui早的一種，始創(chuàng)于20世紀40年代初，由Coons等用異氰酸熒光物質(zhì)標記抗體，檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。至20世紀50年代末期，Riggs等合成性能較為優(yōu)良的異硫氰酸熒光黃（fluorescelnisothioeyanante，F(xiàn)ITC），并由Marshall等對熒光抗體的標記方法進行了改進，從而使熒光免疫技術逐漸推廣應用。20世紀70年代以來，在傳統(tǒng)熒光抗體技術的基礎上，根據(jù)放射免疫和酶免疫測定的原理，發(fā)展建立了各種免疫熒光測定法，可用于定量測定體液中抗原或抗體。近年來由于免疫學各個領域的發(fā)展，在臨床檢查工作中免疫熒光技術已逐漸突出，如自身抗體的檢測，B細胞、漿細胞的功能探索等皆獲得了廣泛的應用。

免疫熒光檢測法是以熒光物質(zhì)（也稱為熒光色素或熒光素）作為標記物，標記抗體（或抗原），與相應的抗原（或抗體）反應，根據(jù)熒光的存在與否來檢測其是否存在。在實際工作中，用熒光素標記抗體檢查抗原的方法較為常用，所以也稱之為熒光抗體技術（fluorescent antibody technique）。

熒光是由熒光物質(zhì)的分子吸收外界能量（如光能等），發(fā)生電子躍遷，而后以光子的形式釋放出能量，停止能量供給，發(fā)光亦立即停止。這個過程中將損失部分能量，因而釋放的光子比激發(fā)光的波長長，二者波長之差反映了熒光物質(zhì)的特征，稱為“stokes改變”。此外，熒光沒有指向性，因而可在任意方向置放檢瀾器，而不一定在激發(fā)光的直線上。

熒光素是一種有機染料，用于抗體標記的熒光素具有以下特點：①通常是環(huán)狀復合物，與延伸物相連接。單鍵與雙鍵的交替數(shù)目越大，被激發(fā)的分子穩(wěn)定性越大，即熒光增強。②分子平面性和硬度越大，熒光傾向越大。③有些分子尤其是螯合物，加入金屬離子可產(chǎn)生強烈熒光。④濃度、溫度、PH值和離子強度均可對分子的熒光效率產(chǎn)生顯著影響。熒光物質(zhì)的稀釋溶液，可在室溫下使用。熒光可采用常見的、相對較便宜而無害的方法來檢測。此外，結合物在一般儲存條件下性能穩(wěn)定，可保存使用較長時間。目前用于標記抗體的熒光素主要有異硫氰酸熒光黃（FITC）、四乙基羅丹明（tetraethlrodamine B200，RB200）、四甲基異硫氰酸羅丹明（tet—ramethyl rhodamine isothio-cyanate，TRITC）÷鑭系稀土元素螯合物、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）及7—氨基—4—甲基香豆素（7—amino-4—methyl couma-rin，AMC>等。其中FITC應用zui廣，羅丹明、PE和AMC常與FITC聯(lián)合使用，作為對比染色或雙標記，特別是PE在流式細胞術（flowcytometry，F(xiàn)CM）中較常用。

與紫外可見分光光度法不同，熒光過程是一個主動的過程，其熒光強度依賴于供能的強度，即樣品熒光信號強度與激發(fā)信號強度成正比。如果激發(fā)信號增強，則熒光信號也增強，因而，采用高強度的光源可大大增強熒光技術的敏感性。這也是熒光檢測法比吸收檢測法更敏感的原因之一。